Как определить концентрацию гемоглобина методом сали

Стандартный анализ крови обязательно включает в себя показатель уровня гемоглобина. Такой анализ называется клиническим и является базой для исследования практически всех заболеваний. Белок гемоглобин находится в клетках крови – эритроцитах. Он выполняет важную функцию клеточного дыхания. Благодаря железу, которое в нём содержится, кровь имеет красный цвет. Колориметрический принцип определения уровня гемоглобина основан именно на таком свойстве пигментации. Как делать такой анализ предложил швейцарский врач Герман Сали (Herman Sahli) в конце 19 века.

Принцип проведения

Определение концентрации гемоглобина

В качестве унифицированного утвержден гемиглобинцианидный метод определения гемоглобина крови. Определение гемоглобина с помощью гемометра Сали (ГС-3) может быть использовано ишь в отсутствие фотоэлектроколориметра, гемоглобинометра1 или спектрофотометра. Метод Сали. Принцип. Гемоглобин крови под воздействием 0, 1 н. раствора хлороводородной кислоты превращается в хлорид гематина бурого цвета, интенсивность окраски его сравнивают со стандартом. Ход определения. В каплю взятой крови, находящуюся в углублении пластинки, вносят кончик чистого и сухого капилляра от гемометра. Плавно, без перерывов, с помощью резинового баллона насасывают кровь в капилляр до круговой метки (0, 02 мл). Уровень крови в капилляре регулируют, прикасаясь к его кончику ватой или фильтровальной бумагой. Вытирают кончик капилляра от крови и вносят его в 0, 01 н. раствор хлороводородной кислоты, находящийся в градуированной пробирке, выпуская кровь в реактив тонкой струйкой, не взмучивая жидкость. Не удаляй капилляр из пробирки, его прополаскивают 2—3 раза надосадочным прозрачным 0, 1 н. раствором хлороводородной кислоты, затем извлекают из жидкости, прикасаясь его кончиком к стенкам пробирки, выдувают остаток жидкости и выносят из пробирки. Кровь с хлороводородной кислотой немедленно смешивают, энергично встряхивая содержимое пробирки. Вследствие гемолиза эритроцитов и образования хлорида гематина жидкость буреет и становится прозрачной. Пробирку от гемометра, на которой нанесена шкала, градуированная в грамм-процентах, через 5 мин после смещения вставляют в гемометр Сали, имеющий два стандарта. Через 5 мин к испытуемой жидкости небольшими порциями прибавляют дистиллированную воду, каждый раз тщательно перемешивая жидкость с помощью стеклянной палочки. Стекающая с палочки жидкость должна полностью остаться в пробирке. В момент, когда цвет жидкости приблизится к цвету стандартов, воду начинают прибавлять осторожно, по каплям. Разведение заканчивают, как только цвет испытуемой жидкости сравняется с цветом стандартов. Цвет жидкости стандартов сравнивают при дневном освещении в проходящем свете, держа в вытянутой руке на уровне глаз. Определяют, какому делению шкалы соответствует нижний мениск жидкости. Цена деления шкалы равна 0, 2 г %. Количество гемоглобина при оформлении в бланке анализа записывают в граммах на 1 л, для чего полученные данные умножают на 10. После определения гемоглобина пробирку и капилляр промывают дистиллированной водой, высушивают, а гемометр укладывают в футляр.

Руководство к практическим занятиям по методам клинических клинических лабораторных исследований: Учеб. Пособие -4-е изд., перераб. И доп.-В.С. Ронин, Г.М. Старобинец.-М.: Медицина, 1989.-320с.

Что представляет собой гемометр Сали

На заметку! Норма гемоглобина в крови мужчин составляет 130-160 г/л, у женщин – 120-140 г/л.

Третья пробирка имеет шкалу, на которой отмечены грамм-проценты и единицы гемометра. Эта ёмкость заполняется анализируемым материалом. Колориметрический анализ производится лаборантом визуально. Анализируемый гематин разбавляют водой до определённого цвета, который сравнивают со стандартным образцом.

Работа №3. Определение гемоглобина методом Сали.

Практические работы. Работа № 1. Забор крови из пальца.

Правильное получение капиллярной крови является одним из решающих условий, обеспечивающих точность и воспроизводимость результатов. Общее время, затрачиваемое на взятие крови, не должно превышать 2 — 3 мин. Во взятой крови должны отсутствовать признаки свертывания.

Оборудование:спирт, вата, стерильный скарификатор, Камера Горяева, покровное стекло, 3,0% раствор NaCl, пипетки на объем не менее 5 мл, капилляры Сали, раствор цитрата натрия, линейка, трансформирующий раствор, стандартный раствор гемоглобина с известной концентрацией гемоглобина (120г/л), спектрофотометр, кюветы.

Ход работы. Вымойте руки с мылом в проточной воде, высушите их. Забор крови производите из большого или безымянного пальца левой руки (допустимо получать кровь из любого другого пальца). Берущий кровь должен пользоваться резиновыми перчатками. Кожу подушечки пальца протрите ватным тампоном, смоченным 70 % спиртом, и дождитесь ее высыхания. Левой рукой слегка сдавите мякоть пальца в области предполагаемого укола. В правую руку возьмите стерильный скарификатор, ориентируя его строго перпендикулярно к поверхности кожи в месте укола. Наиболее удобным местом прокола кожи является точка слева от срединной линии на некотором расстоянии от ногтя. Укол производите на всю глубину острия иглы, рассекая при этом кожу поперек дактилоскопических линий. Первую каплю крови удалите, потому что она содержит случайные примеси, лимфу и поврежденные форменные элементы. Далее забирайте кровь на необходимые анализы. После окончания забора крови к месту прокола приложите ватный тампон, смоченный спиртом или раствором йода. Забор крови из пальца осуществляйте в специальные в каждом случае стеклянные капилляры для стандартизации процесса взятия крови. При этом капилляры предварительно обработайте антикоагулянтом — веществом, препятствующим свертыванию крови — гепарином или раствором лимоннокислого натрия (цитрата натрия).

Работа №2. Подсчет количества эритроцитов в камере Горяева

Принцип метода состоит в подсчете эритроцитов в камере Горяева. Для уменьшения концентрации форменных элементов и создания удобной для подсчета их концентрации кровь предварительно разводится стандартным образом.

Ход работы. Разводят исследуемую кровь в 200 раз. Для этого в сухую пробирку отмеривают 4 мл 3,0% раствор NaCl. Пипеткой набирают 0,02 мл крови. Или с использованием меланжера (смесителя). После тщательного перемешивания раствора крови небольшой каплей заполните подготовленную — с притертым стеклом камеру Горяева. Камеру перед заполнением промойте водой и насухо вытрите. На участок камеры, где нанесены сетки, уложите обезжиренное покровное стекло, при этом нижняя поверхность камеры должна находиться на третьих пальцах обеих рук, двумя вторыми пальцами придерживайте ее спереди. Двумя пальцами притрите покровное стекло, плавно продвигая его по поверхности прямоугольных пластинок до появления цветных колец Ньютона в местах соприкосновения покровного стекла с поверхностью пластинок камеры.

Каплю исследуемой жидкости пипеткой поместите перед щелью, образованной покровным стеклом и пластинкой камеры Горяева с нанесенной сеткой. Капля должна заполнить камеру самотеком (под действием капиллярных сил). Следите, чтобы в пространстве над сеткой не было пузырьков воздуха и избытка жидкости.

До начала подсчета оставьте счетную камеру на 1 — 2 мин для осаждения форменных элементов. Камеру положите на столик микроскопа и настройте его на малое увеличение (объектив 8 — 9, окуляр 10 или 15). Подсчет производите при несколько опущенном конденсоре. Хорошую контрастность обеспечивает фазово-контрастное устройство. Эритроциты считайте в пяти больших квадратах, состоящих из 16 малых (5 ´ 16 = 80 малых), расположенных по диагонали. Для записи результатов рекомендуется предварительно расчертить на листе 5 больших квадратов, разлинованных 4х4 и записывать найденное число эритроцитов в каждую клеточку. При подсчете необходимо помнить правило буквы «Г».

Подсчитав число эритроцитов в 80 маленьких квадратах (N) рассчитывают число клеток в 1 мкл (мм3) крови (X). Для этого учитывается разведение в 200 раз, объем камеры над одним маленьким квадратиком 1/4000 мкл и то, что клетки подсчитывались в 80 таких квадратах. Таким образом, формула для вычисления количества эритроцитов следующая:

Х=(Nх4000х200)/80

где N/80 — среднее число клеток в 1 малом квадрате; 1/4000 — объем камеры под малым квадратом; 200 — степень разведения крови. Внимание! Счет количества клеток в квадратах камеры Горяева проводится по правилу Егорова: к данному квадрату относятся только те клетки, которые находятся внутри квадрата или на его верхней и левой границе.

Полученное количество эритроцитов можно также выразить в количестве на 1л крови (умножением полученного количества на 106), что является стандартной размерностью этого показателя.

Работа №3. Определение гемоглобина методом Сали.

Гематиновый метод Сали основан на образовании устойчивого раствора коричневого цвета при взаимодействии гемоглобина с НС1.

Гемометр Сали представляет собой штатив, задняя стенка которого сделана из матового стекла. В штатив вставлены 3 пробирки одинакового диаметра. Две крайние пробирки запаяны и содержат стандартный раствор солянокислого гематина; средняя – градуирована. Она предназначена для проведения исследования. Стандартный раствор солянокислого гематина по цвету соответствует 167 г/л гемоглобина.

Ход работы. в среднюю пробирку наливают 0,1 Н р-р НСl до нижней метки. Пипеткой берут 0,02 мл кровиизпальца до метки, обтирают ее кончик ватой и выдувают кровь на дно пробирки так, чтобы верхний слой кислоты оставался неокрашенным. Не вынимая пипетку, споласкивают ее кислотой. После этого содержимое пробирки перемешивают и ставят в штатив на 5–10 мин. Это время необходимо для полного превращения Нb в солянокислый гематин. Затем к содержимому пробирки добавляют по каплям дистил. воду до тех пор, пока цвет полученного раствора не будет совершенно одинаков с цветом стандарта (добавляя воду, раствор перемешивают стеклянной палочкой).

Рекомендации к оформлению работы.Цифра на уровне верхней границы полученного раствора, показывает абсолютное содержание Hb в испытуемой крови, выраженное в г-%. Значение следует перевести в г/л, т. е. умножить на 10.

Методика проведения

Для проведения лабораторного исследования крови по методу Сали осуществляют следующие действия. Пустую пробирку гемометра заполняют соляной кислотой до нижней отметки. Концентрация раствора должна составлять 0,1 Н. Далее специальным капилляром, который входит в комплект гемометра, набирают 0,02 мл крови пациента.

Капилляр опускают в кислотный раствор и аккуратно выпускают в него, забранный у пациента, материал. Кровь должна оказаться под слоем кислоты так, чтобы сама кислота осталась прозрачной. Далее содержимое пробирки перемешивают и выдерживают в нетронутом состоянии 5-15 минут. За это время произойдёт взаимодействие жидкостей, и образуется гематин коричневого цвета.

В образовавшееся вещество по капле добавляют дистиллированную воду, пока цвет не станет идентичным с цветом образца в запаянной пробирке гемометра. Каждый раз гематин размешивают стеклянной палочкой. При этом жидкость поднимается, её уровень соответствует шкале контрольной пробирки. Как только цвет анализируемого материала сравняется со стандартным цветом, лаборант отмечает, какому делению шкалы грамм-процентов соответствует поднявшаяся жидкость. Для перевода в необходимые граммы на литр полученную цифру умножают на 10.

Принцип проведения исследования

В основе метода Сали лежит простая реакция преобразования гемоглобина. Для этого в препарат крови добавляется определенное количество хлористоводородной кислоты. В результате в пробирке образуется вещество хлоргематин, коричневого цвета.

Определить содержание преобразованного гемоглобина можно по интенсивности окраса полученной смеси. Для этого раствор разбавляется дистиллированной водой, пока его оттенок не станет идентичным веществу в контрольной запаянной пробирке.

Важно! Со временем содержимое контрольных препаратов выцветает. В результате может быть отклонение полученных данных от реальных показателей на 1-3%.

Насколько точный метод определения гемоглобина