Натощак или нет? Инструкция, как правильно сдавать анализы крови

Инфографика на конкурс «био/мол/текст»: Клинический анализ крови — самый распространенный лабораторный тест, назначаемый врачом, когда мы приходим на прием и жалуемся на плохое самочувствие. «Кровь из пальца, завтра с 8:00 до 9:30, натощак, N-ный кабинет», — такую фразу неизменно слышали несколько поколений. Однако технология исследования крови претерпела большие изменения за последние десятилетия и прошла путь от ручных методов к автоматическим. Разбираемся, как анализировали кровь вашей бабушки и почему сейчас все делается по-другому.

Конкурс «био/мол/текст»-2019

Эта работа опубликована в номинации «Наглядно о ненаглядном» конкурса «био/мол/текст»-2019.

Генеральный спонсор конкурса и партнер номинации «Сколтех» — Центр наук о жизни Сколтеха.

Спонсор конкурса — : крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.

Спонсором приза зрительских симпатий выступила компания BioVitrum.

«Книжный» спонсор конкурса — «Альпина нон-фикшн»

Что будем исследовать?

Кровь — жидкая соединительная ткань организма, состоящая из плазмы и трех типов форменных элементов: эритроцитов, тромбоцитов и лейкоцитов. Лейкоциты, в свою очередь, бывают с гранулами в цитоплазме — это нейтрофилы, эозинофилы и базофилы, — и без гранул — лимфоциты и моноциты. Для того чтобы отличить патологию от нормы, нужно знать, какова концентрация клеток крови, как они выглядят и какую функцию выполняют. Пришло время вспомнить, с кем мы имеем дело.

Итак, специалисты анализируют относительное и абсолютное содержание клеток, их морфологические характеристики, распределение по объему крови и многие другие параметры. Эти показатели могут рассказать, способны ли клетки в полной мере выполнять свои функции, а если нет, то указать на причину их «неработоспособности» и послужить основой для постановки диагноза.

Вперед, в прошлое!

1965 год, 8 утра, в местной поликлинике очередь на анализы. Ваша бабушка сдала кровь, и лаборант относит ряд пробирок на исследование. Проследуем за ним в лабораторию и посмотрим, что там и как. В лаборатории мы видим врачей, склонившихся над микроскопами или работающих с пробирками. Без преувеличения можно сказать, что в молодости вашей бабушки глаз специалиста и микроскоп были основными инструментами для анализа крови. Определяют следующие основные характеристики крови: концентрация каждого типа форменных элементов, количество различных видов лейкоцитов, скорость оседания эритроцитов и концентрация гемоглобина. Помимо этого, специалист рассчитывает гематокрит — отношение объема эритроцитов к общему объему крови [5].

По порядку рас-счи-тайсь!

Первым делом производится подсчет клеток и определяется их концентрация в крови. Подсчет эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов проводят в камере Горяева, названной в честь своего изобретателя. Камера Горяева — стекло с углублением и нанесенной сеткой, куда помещается разведенная в физрастворе капля крови. Для определения количества форменных элементов камеру помещают под микроскоп и считают клетки, находящиеся в больших и маленьких квадратах сетки. Для каждого типа клеток существуют свои правила подсчета и формула, по которой вычисляется их исходная концентрация с учетом разведения крови и количества квадратов сетки [6]. Изменение количества форменных элементов служит важным критерием для диагностики анемии, воспалительных и вирусных заболеваний, нарушений свертывающей системы крови и других патологических состояний [7].

Ты кто такой?

Другой этап исследования крови — дифференцировка лейкоцитов на популяции. Ей уделяется особое внимание: изменение концентрации определенного типа клеток говорит о конкретной патологии. Бактериальная инфекция, вирусы или аллергия? Лейкоциты подскажут, какой поставить диагноз и какое назначить лечение. Различение лейкоцитов доверяют только высококвалифицированному специалисту. Для начала мазок крови фиксируют в спирте и окрашивают по методу Романовского—Гимзы. Состав красителя подобран таким образом, что различные структуры клеток окрашиваются в разные цвета. Окраска зависит от способности компонентов красящей смеси связываться со структурами, содержащими кислоты или основания. Например, гемоглобин и гранулы эозинофилов приобретают красно-розовую окраску за счет эозина, а ядра форменных элементов и базофильные гранулы (имеющие сродство к основаниям) окрашиваются метиленовым синим и азуром в синий цвет [1]. Когда мазок готов, специалист в микроскоп исследует его и по внешнему виду определяет, к какому типу принадлежат разные клетки [8]. Наличие окрашенных гранул, особенности формы ядра, размер клетки — все параметры нужно держать в голове для безошибочной классификации. Обычно подсчитывали сто лейкоцитов с последующим вычислением процентного содержания, а для того чтобы не запутаться, использовали 11-клавишный счетчик [9]. Увидел в микроскоп клетку — нажми на клавишу с обозначением клетки данного типа, и в конце подсчета количество лейкоцитов каждого вида отобразится на экране счетчика [10].

Выпали в осадок

Еще одна характеристика, имеющая клиническое значение — скорость оседания эритроцитов (СОЭ). Это показатель, оценивающий скорость разделения крови на плазму и форменные элементы. В чем причина такого разделения? Макромолекулы, находящиеся в плазме крови, могут связывать одновременно два эритроцита друг с другом, в результате чего образуются «монетные столбики» [11]. Такие комплексы под действием силы тяжести оседают на дно пробирки, оставляя над собой слой прозрачной плазмы — это называется седиментацией эритроцитов. Увеличение скорости оседания эритроцитов указывает на патологические процессы, происходящие в организме, такие как воспалительные, инфекционные или онкологические заболевания [12].

Для определения СОЭ мировое признание получил метод Вестергрена, однако в России также был распространен метод Панченкова. Принцип работы методов одинаков, различаются только типы используемых пробирок. Кровь смешивают с антикоагулянтом — цитратом натрия — и помещают в капилляр — тонкую стеклянную трубочку. Эритроциты оседают на дно пробирки в течение часа, а затем измеряется высота столбика плазмы, образовавшегося сверху [13]. Таким образом получают скорость оседания эритроцитов, выраженную в мм/ч.

На вкус и цвет

Гемоглобин — красный пигмент эритроцитов, связывающий и переносящий кислород и углекислый газ. Снижение содержания гемоглобина в эритроцитах — причина анемий, сопутствующих целому ряду болезней. Концентрацию гемоглобина определяют визуально с помощью гемометра Сали. Прибор выглядит так: по центру — пробирка для анализируемой крови, а по бокам — окрашенные эталонные пробирки. В изучаемую кровь лаборант добавляет соляную кислоту — гемоглобин превращается в гемин бурого цвета. Затем кровь разводят дистиллированной водой, пока ее цвет (по субъективному мнению лаборанта!) не совпадет с цветом эталона. Уровень жидкости, получившийся в центральной пробирке, соответствует концентрации гемоглобина [14].

Как вы уже догадались, 50 лет назад при исследовании крови совершить ошибку было очень просто. Неверное определение вида лейкоцита или сбой при подсчете форменных элементов — все это приводило к неточным результатам анализа. Что было сделано для предотвращения ошибок? Вернемся в наше время и узнаем, как изучают кровь сегодня.

Когда назначается общий анализ крови?

Сдача крови для общего анализа – каждому знакомая процедура, использующаяся как для первичной диагностики, так и в профилактических целях. Инфекции, воспалительные реакции или любые другие патологии влияют на концентрацию в биоматериале тех или иных элементов. Изменение каждого отдельного или нескольких показателей весьма специфично и характерно для разной группы заболеваний.

Клиническое исследование обязательно входит в плановый профилактический осмотр и предшествует любой вакцинации. Назначается сдача биологического материала и перед началом медикаментозного лечения ряда заболеваний, так как некоторые лекарства влияют на состав, а значит и свойства крови. Например, назначение антикоагулянтов противопоказано при низкой концентрации тромбоцитов из-за риска развития внутреннего кровотечения.

Времена меняются

Изменения видны уже на этапе забора крови: если раньше врач собирал кровь в несколько пробирок с реагентами, стеклянный капилляр и делал на стекле мазок, то сейчас используются совсем небольшие объемы — от 12 до 150 мкл [15] крови достаточно, чтобы исследовать ее по всем параметрам.

Заглянем в современную гематологическую лабораторию. Ого! Все заставлено оборудованием, и лаборанта что-то не видно… Может, отошел приготовить себе кофе? Не успеет! Анализ крови будет готов за минуту, и прибор выдаст результат в виде бумажной ленты с числами и аббревиатурами, за которыми скрываются всевозможные параметры.

Современные гемоанализаторы подразделяются на несколько классов, в зависимости от того, что они умеют делать. Каждый последующий класс — новая ступень эволюции — быстрее, точнее, совершеннее. Использование комбинации технологий творит чудеса: если первые анализаторы могли определять восемь параметров крови и не различали виды лейкоцитов [16], то новейшие приборы способны дифференцировать до семи популяций лейкоцитов [17] и в общей сложности исследовать более 40 характеристик крови.

Как сказал Артур Кларк: «Любая достаточно развитая технология неотличима от магии». И действительно, подробнейший результат за столь короткий срок не может не удивлять. Но вся магия основана на физических законах. И хотя такие названия, как электрический импеданс, светорассеяние и фотометрия на первый взгляд немного пугают, сейчас мы разберемся, какие принципы лежат в основе каждой технологии анализа.

Перепись населения

В середине прошлого века Уоллес Культер совершил революцию, запатентовав технологию автоматического подсчета клеток. Его именем назван один из лидеров в сфере производства гематологических анализаторов — компания Beckman Coulter [18]. Апертурно-импедансный метод (или метод Культера) основан на регистрации и анализе импульсов, возникающих при прохождении клетки через апертуру из одной емкости в другую, в каждой из которых находится электрод. Когда клетки в отверстии нет, через электролит между электродами свободно протекает ток под действием электрического поля. Чтобы направить клетки к апертуре, используют насос, откачивающий жидкость из одной емкости, в нее и устремляются форменные элементы. Проходя через апертуру, клетка вытесняет из одной емкости в другую объем электролита, равный своему объему. При этом возникает импульсное изменение сопротивление (импеданса) — мембрана клеток создает препятствие для свободного протекания тока. Одновременно меняется и сила тока, которую регистрирует счетчик. Число возникших импульсов соответствует количеству форменных элементов, а высота импульса пропорциональна объему клетки [19]. Используя информацию о количестве и объеме форменных элементов, прибор может рассчитать гематокрит, среднюю концентрацию гемоглобина в эритроците, ширину распределения клеток по объему и многие другие параметры [15].

Разделяй и властвуй

Дифференцировку лейкоцитов на популяции можно провести с помощью счетчика Культера, однако возникает проблема — различные виды лейкоцитов близки по объему и схожая амплитуда импульсов не всегда позволяет точно установить тип клетки. Как быть? Для решения этой загвоздки подбирают сочетания реагентов, которые изменяют размеры клеток в разной степени так, что становится возможным их разделить [15].

Но наиболее распространенный способ дифференцировки — проточная цитофлуометрия [20]. Метод работает следующим образом: клетки, находящиеся в потоке, поочередно облучаются лазером, а возникающие при этом сигналы светорассеяния и флуоресценции регистрируются детекторами и анализируются. Для того чтобы правильно определить принадлежность к популяции, исследуют сразу несколько параметров. Так, рассеяние света под малым углом дает информацию об относительном размере клеток, а рассеяние света под прямым углом позволяет «заглянуть» внутрь клетки и изучить ее внутреннюю структуру — наличие гранул и форму ядра. Еще один параметр — флуоресценция — способен рассказать о количестве антигенов и их виде на поверхности клеток — такое точно не определить на глаз. В отличие от ручных методов дифференцировки, анализируются не 100–200 клеток, а десятки тысяч в секунду! И к каждому лейкоциту индивидуальный подход: гидродинамическая фокусировка способствует тому, чтобы клетки выстраивались в ряд и облучались в проточной ячейке поодиночке. Результат подсчета появляется на экране в виде диаграмм рассеивания, где клетки со схожими свойствами формируют кластеры.

Выпали в осадок: 2.0

Современные приборы умеют измерять СОЭ двумя принципиально различными способами. Первый — модифицированный метод Вестергрена. Принцип работы не изменился со времен вашей бабушки, но за счет автоматизации стал более быстрым и точным. Второй — измерение кинетики агрегации эритроцитов оптическим методом [21]. Происходит это так: в кровь добавляется антикоагулянт, пробирки с кровью помещаются в ротор, где происходит автоматическое перемешивание. После этого анализатор отбирает часть крови в микрокапилляр, где она ускоряется и резко останавливается (так называемый метод «остановленной струи»). Остановка вызывает агрегацию эритроцитов, и в этот момент с помощью фотометра определяется оптическая плотность крови — чем плотнее будут расположены эритроциты, тем меньше света пройдет через пробу. Прибор использует полученные данные и строит кривую седиментации — ее анализ позволит представить результат в привычных единицах измерения СОЭ [22], [23].

Фото на память

Для определения концентрации гемоглобина Международный комитет по стандартизации в гематологии рекомендует метгемоглобин-цианидный метод. Однако сейчас повсеместно применяется иное исследование, не использующее токсичный цианид. Знакомьтесь, SLS-метод. Назван он по основному реагенту — лауритилсульфату натрия. SLS разрушает мембраны эритроцитов, после чего связывается с группами гема и образует стабильные комплексные соединения. Они анализируется фотометрически — через пробу крови пропускают свет лазера. Комплексные соединения поглощают часть света, в результате этого интенсивность выходящего светового потока ослабевает. Затухание измеряют с помощью фотодатчика и полученные данные преобразуют в единицы концентрации гемоглобина [24].

Как берется кровь и нужна ли подготовка к процедуре?

Для предотвращения занесения инфекции и взятия чистого материала медсестра протирают подушечку одного из пальцев левой кисти смоченным в спирте тампоном. Сразу после этого специальным инструментом, скарификатором, наносят крошечный разрез около 3 мм глубиной. Выступающая из разреза кровь собирается пипеткой для забора и переливается в высокую пробирку. Небольшая часть жидкости мазком наносится на предметное стекло.

Если врачом назначена венозная пункция, на предплечье пациента накладывают резиновый жгут, замедляющий кровоток ниже перевязки. Затем место прокола на внутренней поверхности сгиба локтя дезинфицируют спиртом, после чего вводят в вену полую иглу. Сквозь неё кровь из сосуда наполняет специальную пробирку, а небольшое количество биоматериала наносится на предметное стекло.

Для проведения процедуры специальные приготовления не нужны. Единственное, о чем могут попросить врачи, — не завтракать перед забором биоматериала, так как употребление пищи может исказить полученные результаты.

В ряде случаев делать анализ приходится по нескольку раз за установленный временной отрезок, в том числе, для отслеживания результативности назначенного лечения. Чтобы получить наиболее точные данные для сравнения, повторная сдача крови проводится примерно в том промежутке времени, что и в первый раз.