Определение групп крови моноклональными антителами

Цоликлон – моноклональное антитело, образующееся путем генной инженерии. Чаще всего, для его получения используют мышей – животному вводят специальный антиген, а после получают асцитную жидкость грызуна, в которой и содержатся указанные антитела. Морфологически, они относятся к иммуноглобулинам класса М, т.е. антителам острой фазы. Механизм действия их обусловлен образованием комплекса антиген-антитело, где в качестве антигена выступают некоторые молекулы (в данной ситуации – белки, определяющие группу крови и ее резус), расположенные на мембране клетки.

Для чего проводится анализ?

Группа и резус-фактор – генетически обусловленные характеристики крови, которые наследуются от родителей и остаются неизменными на протяжении всей жизни человека

. Классификация групп крови осуществляется, исходя из определенного набора биохимических параметров и состава антигенов, и насчитывает 4 основных группы. Переливание пациенту крови несовместимой группы или с другим резус-фактором несет с собой смертельную опасность – иммунная система начинает вырабатывать антитела против чужеродных клеток, которые атакуют и разрушают их. Именно по этой причине в ситуациях, которые несут с собой риск обширной кровопотери, необходимо точное определение принадлежности крови и резус-фактора как у донора, так и у реципиента.

Типирование на плоскости

1. Промаркируйте пластину: укажите ФИО пациента и название реагента.
2. Нанесите на плоскость одну каплю (приблизительно 0,1 мл) реагента Анти-Д-Супер.
3. Рядом поместите одну маленькую каплю (0,01 – 0,05 мл) эритроцитов.
4. Чистой стеклянной или пластмассовой палочкой смешайте две капли.
5. Подождите 10 – 15 секунд.
6. Плавно покачивайте пластинку на протяжении 20 – 30 секунд.
7. Оцените результат через 3 минуты.

Обычно характерная крупнолепестковая гемагглютинация наблюдается спустя 30 – 60 секунд, но при наличии антигена Du время реакции увеличивается. Подогревание пластины до 37 °С увеличивает скорость реакции.

Что такое цоликлоны?

Цоликлон — это солевой раствор моноклональных антигенам к антител эритроцитов человека. Моноклональные антитела для употребляют определения группы крови. Для их используют получения гибридомную технологию. Цоликлоны анти-А и созданы-В анти для определения групп крови системы человека АВО взамен стандартных изогем-сывороток агглютинирующих.

Цоликлоны анти-А и анти-В являются гибридомных продуктом клеточных линий, приобретенных в итоге мышиных слияния антителообразующих В-лимфоцитов с клеточками мышиной опухоль (миеломы костного мозга). Личные гибридомные продуцируют полосы гомогенные антитела только 1-го класса которые, иммуноглобулинов целиком схожи по структуре и био Антитела. активности, продуцируемые клеточками 1-го клона (потомство клеточки одной), являются моноклональными.

В антителах клеток одной специфики, происходящих из 1-го образует, лимфоцита клеточки 1-го клона. Главное заключается в нужно: последующем получить от одной клеточки специальные наработать и антитела их в огромном количестве. Трудность заключается в задач 2-ух преодолении: во-1-х, обычные клеточки после нескольких гибнут делений; во-2-х, только раковые клеточки способны плодиться неограниченно. Для решения этих 2-ух несопоставимых 1975 в заморочек году Г. Кёлер и К. Мильштейн сделали модификации клеточные, либо гибридомы. Гибридомы — это обычных слияние лимфоцитов в питательной среде с клеточками Лимфоциты. миеломы в этой среде не гибнут, а от миеломного получают напарника возможность нескончаемо плодиться. Подобным гибридомный, образом клан плодится, а в итоге этого образуются процесса моноклональные антитела.

Техника определения в пробирке

1. Подготовьте 5 % взвесь отмытых эритроцитов в физрастворе.
2. Добавьте в пробирку 0,1 мл цоликлона Анти-D-Супер (Анти-D IgM) и одну каплю эритроцитов.
3. Перемешайте содержимое.
4. Инкубируйте пробирку на протяжении получаса. Скорость реакции увеличивается при подогреве пробирки до 37 °С с использованием водяной бани или термостата.
5. Центрифугируйте пробирку со скоростью 1500 — 2000 оборотов в минуту при комнатной температуре на протяжении полминуты.
6. Слегка встряхните пробирку для отделения осадка от дна.
7. Визуально оцените наличие агглютинации. При обнаружении антигена D образуются один или несколько явно различимых агглютинатов на фоне прозрачного раствора NaCl. В противном случае осадок легко разбивается и является непрозрачной гомогенной взвесью.

Как проводится исследование?

Для определения группы крови с использованием цоликлонов необходима плоская ровная поверхность (планшетка), смоченная водой, набор химических реагентов и пробы биологической жидкости, причем специалист может использовать любую кровь: капиллярную, венозную, замороженную и т. д.

1. Стороны планшета помечают, чтобы не перепутать, на какую из них будет нанесен тот или иной тип цоликлонов.

2. На поверхность капают по одной капле реагентов (обычно цилоклоны анти-А и анти-В) и крови, причем объем химических веществ должен в 8-10 раз превышать объем биоматериала.
3. Подождать 3-5 минут, аккуратно покачивая планшет, чтобы жидкости хорошо смешались, а эритроциты не оседали по краям образцов.

Спустя несколько минут наступит реакция, по которой можно с высокой точностью определить принадлежность крови к определенной группе.

Процедура определения группы крови

Процедура, как определить группу крови с помощью цоликлонов, очень проста и проводится за несколько минут. Для нее потребуется нативная («живая») капиллярная кровь, допускается наличие в ней консерванта. Также понадобится планшет — плоская поверхность из стекла, на которой будет происходить реакция. Процедуру проводят по определенному алгоритму:

1. нанести две большие капли цоликлонов на поверхность планшета (обычно реагент анти-А находится слева, а анти-В — справа);
2. добавить небольшие капли крови, которые по объему будут в 10 раз меньше реагентов;
3. аккуратно двигать планшет, чтобы кровь смешалась с раствором, но две капли не соединились друг с другом;
4. через несколько минут наблюдать результаты.

Для установления группы подойдет и кровь с добавлением консерванта. Однако простота методики позволяет проводить ее на месте непосредственно после взятия биологического материала. Достаточно набрать небольшое количество капиллярной крови из пальца, чтобы ее полностью хватило для проведения анализа.

Расшифровка результатов

Определение группы эритроцитарных антигенов и резус-фактора давно стало одним из обязательных исследований для большинства пациентов, поступающих на стационарное лечение. Его проведение возможно на любом уровне оказания медицинской помощи при условии наличия необходимых реагентов и инструментов.

Обычно, определение группы проводится с помощью стандартных сывороток, хотя, конкуренцию ему составляет еще один метод, сходный по методике проведения с эталонным использование цоликлонов.

Цоликлон моноклональное антитело, образующееся путем генной инженерии. Чаще всего, для его получения используют мышей животному вводят специальный антиген, а после получают асцитную жидкость грызуна, в которой и содержатся указанные антитела.

Морфологически, они относятся к иммуноглобулинам класса М, т.е. антителам острой фазы. Механизм действия их обусловлен образованием комплекса антиген-антитело, где в качестве антигена выступают некоторые молекулы (в данной ситуации белки, определяющие группу крови и ее резус), расположенные на мембране клетки.

Таблица. Реакции разных групп крови с цоликлоном анти-А и анти-В.

Медицина, 7

Кохан Т.Г, Пятихатка Н.В.

Специализированная медико-санитарная часть № 6 г. Днепропетровск

Сравнительная характеристика определения групп крови и резус-фактора различными методами

Задачей нашей работы являлось сравнительное изучение определения групп крови при помощи стандартных изогемагглютинирующих сывороток (в двух сериях), изготовляемых на базе станции переливания крови СМСЧ-6, а также при помощи стандартных эритроцитов (перекрестным методом) и тест реагентами анти-А и анти-В. В отличие от стандартных сывороток, последние характеризуются более высокой чувствительностью и стабильностью, что позволило выявлять не только А1 и А2 в эритроцитах группы А (II) и АВ (IV) но и более редко встречающиеся разновидности антигена А (ІІ), что не всегда удавалось при использовании стандартных изогемагглютинирующих сывороток [1]. Принимая во внимание высокую специфичность и активность моноклональных антител, мы использовали один титр тест-реагентов анти-А и анти-В [2]. Тест реагент «анти-DR супер» использовали в комплексе с изоиммунными анти-Rh0(D) сыворотками.

Природа иммунологических осложнений была установлена в 1901 году с открытием первых антигенов групповой системы АВО. В настоящее время известно около 300 групповых антигенов крови, объединяемых в 25 групповых систем: MN, Келл, Даффи, Кидд, Лютеран, Сид, Картрайд, Йорк и др. В клинической практике кровь тестируется только по трем групповым антигенам (А, В, Rh0) двух групповых систем (АВО и резус). Под группами крови АВО подразумевают различные сочетания антигенных свойств эритроцитов (агглютиногенов) и антител по отношению к ним (агглютининов), находящихся в плазме крови [3].

Резус-фактор представляет собой агглютиноген, впервые обнаруженный в эритроцитах обезьяны Macacus rhesus.

Все исследования проводили по методике, утверждённой инструкцией [4].

Как показали 12-ти летние наблюдения во время работы не всегда моноклональные тест-реагенты (указанной фирмы [2]) и стандартные сыворотки показывают один и тот же результат в случае трудноопределяемых групп крови и резус фактора. Проблемную кровь с исследуемой пробирки приходится использовать многократно, дублируя все способы определения или группы крови, или резус-фактора, чтобы выдать правильный результат (подгруппные А2 и А2В). Единично, но бывают такие случаи, что одному врачу-лаборанту нельзя точно определить резус-фактор и выдаваемый результат отражает лишь вероятностную характеристику, что включает и жизненные показатели пациента (табл. 1).

Один из ведущих отечественных иммунологов прошлого столетия, автор метода определения резус-фактора в сывороточной среде на чашках Петри проф. Н.И.Блинов в своем фундаментальном труде «Учение о группах крови» (1940г.) указывал: «Ошибки, зависящие от биологических свойств крови можно разбить на две группы. С одной стороны, наблюдаются случаи, когда реакция агглютинации не наступает там, где она должна быть, с другой стороны, она появляется там, где ее не должно быть». Резюмируя сказанное, можно сделать вывод об актуальности и сейчас того, что определение группы крови и резус-фактора у человека является очень кропотливой работой, требующей большого внимания и напряжения в течение всего рабочего дня.

Таблица 1

Сравнительное определение резус-фактора различными методами

Пояснение: титр-серия — маркировка на стандартных сыворотках, для каждой группы имеется по 2 варианта сывороток, отличающихся донором и титром (в установленных пределах), хотя последний и не указывается.+/─
— наличие или отсутствие агглютинации.
Таблица 2

Сравнительное определение группы крови различными методами

Пояснение:+/─
— наличие или отсутствие агглютинации.
Двенадцатилетний опыт работы показывает, что моноклональные антитела (цоликлоны) очень хороши для определения группы крови и резус-фактора, когда у пациентов нормальный гемоглобин и он здоров, а вот для оперирующихся больных в урологии, гнойной хирургии, терапевтическом отделении, кардиологии, гинекологии с помощью цоликлонов можно дать неправильный ответ (табл. 2) в следующих случаях:

а) если Hb от 30 до 47 г/л – лучше определять группу крови и резус-фактор гемагглютинирующими сыворотками и перекрестным методом. Цоликлоны не срабатывают, не наступает агглютинация , т.к. очень мало эритроцитов;

б) больные раковой патологией и находящиеся в реанимационном отделении. Когда срочно надо делать переливание, а пациенты уже получили очень интенсивное медикаментозное лечение;

в) у новорожденных (из вен пуповины);

г) у беременных женщин с хроническими заболеваниями.

Это объясняется не только сниженным от нормы уровнем гемоглобина, но и наличием в крови различных лекарственных препаратов. Последнее в литературе практически неосвещено и требует дополнительных исследований.

Учитывая специфику основной работы, дополнительно проведен анализ процентного соотношения групп крови (табл.3, рис. 1). На протяжения последних пяти лет в серологической лаборатории было обследовано 27035 человек, проанализировав результаты их группы крови и резус-фактора, можно сказать, что 32% составляют пациенты первой группы, 37% — пациенты второй группы, 22%- третьей и 9%- четвертой. Самой распространенной в Кировском и Красногвардейском районах является группа A (II) Rh+.

Таблица 3

Распределение пациентов по группам крови и резус фактору (в Кировском и Красногвардейском районе г. Днепропетровска)

Рисунок 1

Распределение пациентов по группам крови и резус фактору (в Кировском и Красногвардейском районе г. Днепропетровска).

Подводя итог, можно утверждать, что определение группы крови и, тем более, резус-фактора является неоднозначным процессом и требует использования нескольких методик и различных тест-реагентов для установления истинного результата. Причины необходимости, но недостаточности применения того или иного тест-реагента различны. В случае использование антител возможна их недостатосная специфичность и способность к перекрёстным реакциям. Отдельной и наиболее значимой причиной неясного результата является так называемая проблемная кровь, имеющая, как правило, низкий гемоглобин; однако есть и другие факторы: использование фармакологических препаратов (в том числе наркотиков) и некоторые заболевания пациента. В отношении определения резус-фактора можно говорить о благоприятном статистическом распределении пациентов (рис. 1) в данном районе, что дополнительно позволяет избежать ошибки (низкий процент людей с отрицательным резус-фактором).

Всё это требует дополнительных исследований, но уже сейчас необходимо вводить электронные чипы с биометрическими данными каждого пациента, что позволило бы сделать каждый проблемный анализ уникальным и дало бы возможность не только установить причины ошибочных или неясных результатов, но и разработать соответствующие методики для такой крови с учётом текущего состояния пациента. А такие данные паиента как ВИЧ статус, наличие инфекций, передающихся через кровь, употребление психотропных препаратов позволит повысить безопасность труда персонала лаборатории.

Литература

1. Изоиммунология и вопросы клиники и лечение гемотрансфузионных осложнений. Сборник инструкций и указаний под ред. Умновой М.А и др. -М.: Медицина. 1979. -264 с.

2. Регистрация иммунологического препарата № 581/06-3002 00 000, г. Харьков.

3. Минеева Н.В. Группы крови человека. Основы иммунологии. С.-П. — 2007.

4. Визначення груп крові за системами АВ0, резус та імунних антитіл. Iнструкція, затверджена наказом Мiнiстерства охорони здоров′я вiд 05.07.1999 №164.

Что следует учитывать при проведении анализа?

Чтобы результат анализа был максимально достоверным, при проведении процедуры необходимо соблюдать ряд условий:

• реагенты должны храниться в холодном месте при температуре +2-8 градусов во флаконах с плотно закрученной крышкой (в случае нарушения правил хранения они быстро теряют свои свойства);
• для проведения анализа нельзя использовать цоликлоны с истекшим сроком хранения (он составляет около 30 дней) или жидкости, которые содержат осадок, хлопья или мусор;
• исследование выполняется в хорошо освещенном помещении при температуре воздуха не ниже +15 и не выше +25 градусов, причем в нем не должно быть грязи, пыли и других факторов, способных исказить результат;

• при нанесении биоматериала и реагентов на поверхность планшетки следует точно соблюдать пропорции – если крови будет слишком много, реакцию сложнее отследить, а в противоположном случае (при малом объеме) она будет слишком медленной;
• нельзя допускать, чтобы капли крови, смешанные с разными типами цоликлонов, сливались вместе – если это случилось, исследование проводят заново; по этой же причине для смешивания реагентов с биоматериалом следует использовать разные палочки.

Продолжительность реакции должна составлять не менее 3 минут, а при сомнительном результате время наблюдения за образцами биоматериала следует продлить до 5 минут. Однако по истечении 10 минут может произойти подсыхание биоматериала и естественное выпадение эритроцитов в осадок, поэтому доверять такому исследованию не стоит.

Полезные советы

Определение группы и резус-фактора крови с использованием цоликлонов считается одним из самых простых и доступных методов, поэтому широко применяется в лабораториях разного уровня. Кроме того, такой анализ дает достоверные результаты. Однако в некоторых случаях они бывают ложными, а причиной этому становится несоблюдение нескольких правил. Простая инструкция по применению цоликлонов и работа с ними позволит избежать получения недостоверных результатов и необходимости проводить исследование заново:

• хранить реагенты в холодильнике, при температуре от 2 до 8 градусов, а распечатанный флакон использовать в течение 30 суток;
• исследования проводятся при комнатной температуре, а в слишком жарком помещении рекомендуется периодически охлаждать стеклянную поверхность планшета;
• обозначать на планшете разные цоликлоны маркером, поскольку их цвет после добавления крови быстро исчезает;
• соблюдать правильные пропорции реагентов: если крови будет слишком много, реакция агглютинации эритроцитов будет мало выражена;
• не допускать смешивания капель жидкости, в которых уже присутствуют разные типы цолкиклонов — в таком случае реакцию придется проводить заново;
• обозначать окончательный результат не менее, чем через 3 минуты после начала реакции.

Важно также соблюдать последовательность действий во время анализа. Так, если стеклянную поверхность не раскачивать, даже при отсутствии реакции склеивания эритроциты будут расположены в краевой зоне капли. Это может стать причиной неправильной интерпретации результатов. При определении группы крови необходимо учитывать острые и хронические заболевания, которые наблюдаются у пациента. При патологиях печени и органов кроветворной системы, а также болезнях, которые протекают по типу сепсиса, может происходить явление патагглютинации. Эритроциты будут склеиваться даже при контакте с обычным физиологическим раствором. Напротив, при лейкозе кровяные клетки не отреагируют на присутствие антител, и агглютинация не произойдет.

Цоликлоны — это важные реагенты, которые используются ежедневно в гематологических лабораториях. Они позволяют быстро и безошибочно определить группу крови и ее резус без дополнительного оборудования и специальных навыков. Однако важно выполнять простой алгоритм, чтобы результаты анализа действительно были достоверными.

Для чего необходим анализ?

В настоящее время цоликлоны используются преимущественно для определения группы крови и резус-фактора. Исследование может проводиться как планово, по назначению участкового врача-терапевта, так и по экстренным показаниям, когда требуется переливание крови (в ходе операции произошла массивная кровопотеря или пациент был доставлен с обширной травмой и массивным кровотечением). В поликлинике определение группы проводится преимущественно за счет использования сывороток.

Группа крови по цоликлонам определяется чаще всего в стационаре или специализированных лабораториях. К использованию цоликлонов прибегают, обычно, при невозможности использования сывороток. Скорость получения результатов несколько быстрее, чем при исследовании стандартными сыворотками, что делает методику более универсальной. Многие лаборатории стремятся перейти на использование данного метода.